一、目标基因和区域的选择

目标基因的选择

• 依据：检测产品临床预期用途、基因临床价值、证据等级
• 基因变异分级：明确临床意义、潜在临床意义、临床意义未明、无害或可能无害
• 本地化分级标准：基于2017年AMP/ASCO/CAP指南，I类变异A类证据含NMPA批准疗法，II类变异C级证据增加NMPA批准疗法
• 基因分类：I类基因（明确临床意义）、II类基因（潜在临床意义）、III类基因（临床意义未明）
• 纳入III类基因价值：规避探针组合频繁更新，提升MRD监测灵敏度和特异度
• 共识意见：建立本地化基因变异分级标准和基因证据等级分类体系，构建目标基因筛选框架时整合部分III类基因

目标区域的选择

• 依据：目标基因变异类型、基因组指标、生信质控指标性能要求
• 基因突变检测设计策略
  • SNV、InDel：原癌基因锁定功能结构域及热点突变区域，抑癌基因覆盖完整编码区
  • CNV：目标区域为基因全编码区或满足最小外显子覆盖要求，添加参考SNP位点
  • 融合基因：聚焦已知断点富集区域，采取适应性设计策略
• 基因组标志物检测设计策略
  • TMB：探针覆盖编码区1 Mb以上，增加高频变异区域
  • MSI：动态优化策略，筛选最佳微卫星位点组合，优先选择单核苷酸位点
  • HRD：参考专家共识框架，筛选SNP位点遵循空间分布均匀和杂合位点密度优先原则，建立三级排除机制
• 质量控制模块：包含肿瘤纯度推算、样本配对分析、污染率评估、性别判断系统，通过SNP基因分型实现前3项指标计算，性别鉴定模块采用染色体特异性覆盖策略
• 共识意见：目标区域设计整合“检测功能模块”和“质量控制模块”，根据产品预期用途个性化设计

基因组合的方式

• 推荐列表：形成《常见实体瘤基因检测推荐列表》，明确基因临床证据等级和推荐检测目标区间，筛选Ⅲ类基因依据肿瘤信号通路相关基因及高频突变基因
• 基因组合设计场景
  • 按临床预期用途：单一场景或复合场景，适用于单癌、多癌、泛癌检测产品
  • 按肿瘤来源系统：针对不同系统肿瘤设计多癌检测产品
  • 按基因组指标关联治疗方式或肿瘤类型：筛选特定治疗方式适用人群
• 共识意见：形成推荐列表，设计时根据不同场景进行目标基因组合，实现双重经济学效益

二、体细胞突变分类等级

推荐级别

• 1类：基于高级别证据，专家意见高度一致
• 2A类：基于低级别证据或缺少证据，专家意见高度一致；或基于高级别证据，专家意见基本一致
• 2B类：基于低级别证据或缺少证据，专家意见基本一致
• 3类：专家意见明显分歧

现有分类体系

AMP/ASCO/CAP

• I（明确临床价值）
  • A：FDA批准/专业指南推荐
  • B：足够统计学效能的临床研究证实、获得专家共识
• II（潜在临床意义）
  • C：FDA在其他癌种批准疗法或在研疗法；多项已发表小型研究、获得部分共识
  • D：临床前研究或少量个案报道、未获得专家共识
• III（临床意义未明）
• V（无害或可能无害）

ESMO - ESCAT

• I级（标准治疗）
• II级（前瞻性研究优选方案）
• III级（药物在其他癌症类型中有效）
• IV级（临床前研究预测）
• V级（药物有效，但不延长PFS和OS）
• X级（无证据证明是靶点）

OncoKB

• 1（FDA获批）
• 2（指南推荐）
• 3A（有临床研究结果）
• 3B（获批其他癌种）
• 4（临床前研究）
• R1（标准治疗耐药）
• R2（非标准治疗耐药）

FDA等级

• I类（CDx）
• II类（指南级变异）
• III类（潜在临床价值）

本地化体细胞突变分类等级

• Ⅰ类变异（有重要的临床意义）
  • A级证据：FDA/NMPA批准疗法；专业指南推荐
  • B级证据：经过有足够统计学效能的临床研究证实，获得该领域专家共识
• Ⅱ类变异（有潜在的临床意义）
  • C级证据：FDA/NMPA在其他癌种批准的疗法或在研疗法；多项已发表小型研究，获得部分共识
  • D级证据：临床前研究或少量个案报道，未获得专家共识
• Ⅲ类变异（临床意义不明）：在全人群或特定人群数据库、泛癌种或特定肿瘤数据库中均未观察到较高变异频率；缺乏令人信服的已发表肿瘤相关证据
• Ⅳ类变异（无害或可能无害）：在全人群或特定人群数据库中观察到高变异频率；无已发表的肿瘤相关证据

三、探针/探针池的设计及性能评估

探针的设计和筛选

• 设计原则：根据目标捕获区间参考基因组序列，考虑人群遗传多样性、特定基因突变等因素，确保高覆盖度，提高灵敏度、特异度和均一性
• 影响因素
  • GC含量：50% - 60%时，捕获效率和均一性最优
  • 熔解温度Tm：与GC含量、探针长度及杂交反应条件有关，结合湿实验调整
  • 交叉杂交：评估相似性高的目标区间，剔除相似区域过多的探针
  • 探针长度：常规60 - 120 nt，兼顾杂交稳定性、合成可行性和成本
• 设计策略：调整单条探针起始位置，运用多重叠瓦策略，遵循目标区间中心对称原则滑窗操作
• 共识意见4：考虑目标区域序列多样性（2B类）；考虑多因素，筛选最优探针组合（2A类）

探针池的质量控制及性能评估

• 质量控制
  • 质检方式：单条探针质检和/或混合探针池NGS质检
  • 保存方式：干粉状态运输和长期保存，不同状态不同储存温度
• 性能评估
  • 测序数据质控评估
    • 评估参数：捕获效率、均一性、GC含量/偏好、基因组比对率等
    • 参考标准：捕获效率、Fold - 80、0.2倍平均深度碱基覆盖度、GC含量、GC偏好、基因组比对率等有相应参考值
  • 单条探针/单个位点的检测性能评估
    • 评估指标：深度系数
    • 处理方法：优化探针设计或声明检测性能局限性
  • 基因变异及基因组指标的检测能力评估
    • 评估方法和标准：参考相关专家共识
    • 样本要求：针对不同变异类型和基因组指标选择样本
• 共识意见5：使用标准品及临床样本评估，内容包括测试质控、深度系数、LoD和准确度（1类）

四、探针变更

变更情形

• 变更探针合成供应商：因成本结构优化、应对供应链风险等，优先选探针类型相同、合成原理及质控标准可比且序列一致的合作方，参考ISO 13485认证厂商工艺参数评估
• 部分探针浓度调整或部分区域探针加密：检测性能要求改变时，通过提高浓度或加密探针实现，造成测序深度和检测限变化，形成新检测产品
• 探针序列修改、删减和增加：基因变异临床价值改变，检测范围改变，形成新检测产品

性能评估

• 供应商变更：用20例以上原探针池测试临床样本评估，内容包括测序质控、深度系数、检测准确度，标准为下机数据与原探针相当或无显著差异，深度系数满足要求，检测一致率100%
• 形成新检测产品：除上述评估外，参考《实验室自建肿瘤全景变异检测性能确认中国专家共识（2024版）》重新确认关键参数和性能

生信分析流程更新

• 交付使用前匹配新流程，如更新bed区间、CNV基线、MSI基线等

技术文档与合规

• 生成标准化技术文档：包括供应商工艺可比性、探针性能、升级产品性能确认报告等
• 伴随诊断用途变更：提交NMPA补充申请并履行注册变更程序

共识意见

• 确保新探针池测序数据质控和深度系数满足要求，匹配更新生信分析流程
• 仅供应商变更：与变更前探针进行基因标志物准确度评估，纳入全部基因变异类型及标志物
• 目标区域或部分探针浓度变更：从产品维度重新确认关键参数、LoD和准确度（推荐级别：2B类）

五、总结

• 技术挑战
  • 需检测的基因变异和标志物增多，靶基因与靶区域增多
  • NGS技术全流程复杂，提高探针池性能评估门槛
  • 探针池杂交捕获效率和特异性决定检测结果准确度与可靠性，缺乏系统质量标准和技术共识
• 共识目的：建立基于NGS技术的肿瘤CGP检测产品探针设计全流程质量管理体系
• 技术规范核心维度
  • 临床价值相关性驱动的靶区筛选机制：涵盖目标基因/区域筛选标准和临床证据权重要求
  • 探针设计及性能评估标准：包括探针覆盖率、均一性、重复序列规避等技术指标
  • 探针变更的科学验证流程：涉及生物信息学预测与干湿实验验证的联合评估框架
• 适用范围说明
  • 技术路径：基于DNA靶向捕获测序的CGP检测产品
  • 目标基因推荐肿瘤类型：实体肿瘤
  • 临床证据来源：FDA/NMPA批准伴随诊断、权威临床指南、高质量循证研究（截止2025年5月）
  • 企业建立动态证据评估机制，及时修正检测方案
  • 技术指标随行业发展优化，以最新标准为执行依据